一文詳解酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）原理

    ELISA是“酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)”的縮寫。ELISA廣泛用于定量未知溶液中的蛋白質(zhì)或抗原的研究方法，或在醫(yī)學(xué)上用作診斷工具。ELISA靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，可用于檢測(cè)血液樣本中是否存在傳染病抗體、檢測(cè)新分離的抗體與其靶蛋白的結(jié)合情況，或用于其他各種依賴于抗原-抗體結(jié)合（抗體-抗原相互作用）的檢測(cè)。

    Elisa檢測(cè)原理

    ELISA使用96孔板，孔板是聚苯乙烯材質(zhì)使檢測(cè)樣本吸附在其表面。固定化使抗原與其檢測(cè)抗體結(jié)合，然后洗脫未結(jié)合的抗體，最后進(jìn)行抗原測(cè)定。與檢測(cè)抗體連接的酶將與在最后一步中添加的底物相互作用，產(chǎn)生與抗原成比例的信號(hào)。

    四種ELISA類型

    1、直接ELISA：將含有目的抗原的未知樣本直接粘附在孔中，然后用一抗進(jìn)行檢測(cè)。

    2、間接ELISA：開(kāi)始方式與直接ELISA相同，但一抗不與酶連接，必須使用二抗進(jìn)行檢測(cè)。

    3、夾心ELISA：首先將抗體吸附到板上。然后加入含抗原的樣品，抗原被固定的抗體捕獲，并進(jìn)行檢測(cè)，類似于直接或間接方法。

    4、競(jìng)爭(zhēng)性（或抑制性）ELISA：其設(shè)置與其他三種方法類似，但標(biāo)記的是抗原而不是抗體。在未知樣本之后添加標(biāo)記抗原，以觀察樣本中有多少未標(biāo)記抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)。與其他三種方法不同，競(jìng)爭(zhēng)性ELISA信號(hào)更強(qiáng)，意味著競(jìng)爭(zhēng)較少，因此未知樣本中的抗原也較少。

圖 1.夾心 ELISA 檢測(cè)示意圖

    間接ELISA與直接ELISA的區(qū)別

    間接和直接ELISA（圖2）的唯一區(qū)別在于所使用的檢測(cè)抗體。

    直接ELISA僅使用一種抗體。這種一抗直接與檢測(cè)酶偶聯(lián)。間接ELISA的起始方法與直接ELISA相同，但需要兩種抗體，即一抗和二抗進(jìn)行檢測(cè)。

圖 2.直接檢測(cè)（左）免疫測(cè)定法速度最快，但嚴(yán)格度較低，因此非常適合需要快速讀數(shù)但對(duì)準(zhǔn)確性要求不高的檢測(cè)。間接檢測(cè)（右）免疫測(cè)定法通過(guò)引入偶聯(lián)二抗，提高了直接檢測(cè)免疫測(cè)定法的特異性。

    間接ELISA有何用途？

    間接ELISA用于檢測(cè)樣本中的抗體以量化免疫反應(yīng)。

    直接ELISA有何用途？

    直接ELISA適用于表位定位、定量和定性抗原檢測(cè)以及抗體篩選。

    夾心ELISA測(cè)試的目的是什么？

    最常用的ELISA檢測(cè)之一是夾心法（圖1），常用于過(guò)敏測(cè)試或檢測(cè)食品中的過(guò)敏原蛋白以進(jìn)行質(zhì)量控制。夾心法ELISA的靈敏度比直接或間接ELISA法高2-5倍。該檢測(cè)在96孔板中進(jìn)行，可同時(shí)檢測(cè)多種條件和重復(fù)樣本。

    夾心ELISA的步驟/方法

    夾心ELISA檢測(cè)使用微孔板讀數(shù)儀進(jìn)行?？椎捉Y(jié)合有針對(duì)目標(biāo)抗原的特異性抗體。將樣品放入孔中，如果樣品中存在目標(biāo)抗原，該抗體將與固定的抗體結(jié)合。然后使用標(biāo)記的第二抗體檢測(cè)結(jié)合的抗原。檢測(cè)抗體與一種酶偶聯(lián)，當(dāng)加入底物時(shí)，該酶會(huì)引起顏色變化，因此可以使用微孔板讀數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)。也可以使用HRP二抗（例如用于化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡法的二抗）進(jìn)行檢測(cè)。基于吸光度的酶標(biāo)儀，可測(cè)量與酶反應(yīng)產(chǎn)物相關(guān)的特定波長(zhǎng)的光吸光度。吸光度酶標(biāo)儀可定量分析陽(yáng)性樣本和陰性樣本之間的差異。

綜上所述，ELISA技術(shù)的廣泛應(yīng)用證明了其在現(xiàn)代科學(xué)檢測(cè)中的重要地位。對(duì)于每一位科研工作者來(lái)說(shuō)，掌握其原理并非紙上談兵。只有深刻理解從抗體包被、封閉到酶促反應(yīng)的每一步細(xì)節(jié)，我們才能在面對(duì)復(fù)雜的生物樣本和微弱的信號(hào)時(shí)游刃有余，精準(zhǔn)地解決實(shí)驗(yàn)難題，從而真正發(fā)揮這項(xiàng)經(jīng)典技術(shù)的最大潛力，為科學(xué)發(fā)現(xiàn)提供堅(jiān)實(shí)可靠的數(shù)據(jù)支持。